黄曲霉毒素总量免疫亲和柱

使用对象

黄曲霉毒素总量免疫亲和柱能够特异性的纯化与浓缩样品中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。黄曲霉毒素免疫亲和柱广泛地应用于粮食、食品、饲料、坚果、花生、酱油、醋、辣椒、胡椒、药材和酒类等样品的提取，该方法速度快、操作简单、准确性高，对准确灵敏的测定样品中中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2起到十分重要的作用。

黄曲霉毒素总量免疫亲和柱适用于以下标准：

GB/T 18979-2003 食品中黄曲霉毒素的测定-免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法

SN/T 1101-2002 进出口油籽及粮谷中黄曲霉毒素的检测方法

GBT 30955-2014 饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法

GB/T5009.22-2016 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定

原理

样品经提取液提取、过滤、稀释，然后通过键合有黄曲霉毒素特殊抗体的免疫亲和柱。此时，黄曲霉毒素被亲和柱中的抗体特异性的吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将黄曲霉毒素从亲和柱上洗脱下来。之后，用HPLC或荧光计进行定量检测。

储存条件

该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。

实验溶液制备

• 提取液，甲醇/水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水，混合均匀。
• 提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均匀。
• HPLC流动相，甲醇/水（45+55）：取450mL甲醇加550mL水，混合均匀，用0.22微米的尼龙筛过滤。
• 标准溶液的配制：取黄曲霉毒素混标（G1010，B1和G1为1.0ug/mL,B2和G2为0.3ug/mL），流动相为稀释液，配制标准品溶液。例如：取100uL标准品原液于10mL容量瓶中，用10mL流动相定容至10mL，那么，黄曲霉毒素B1和G1为10ng/mL，黄曲霉毒素B2和G2为3ng/mL.

    注：配制好的标准品溶液2-8℃冷藏保存有效期为24h。

• pH 7.0 PBS溶液：称取8.0g氯化钠，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，之后用纯水稀释至1000mL。
• 0.1%的吐温/PBS：将1.0mL吐温-20加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混匀。
• 1%Tween-20PBS或1%TritionX-100 PBS溶液：将10.0mL Tween-20或TritionX-100加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混匀。

液相色谱条件

色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流动相：甲醇-水（45+55，v/v）

流速：0.8mL/min

检测器：荧光检测器，激发波长360nm,发射波长440nm

进样体积：20~100uL

光化学衍生化系统：光化学衍生器有两接口（不分进出），分别与色谱柱出口或荧光检测器进口连接

 

分析步骤

1国标GB/T5009.22-2016 方法：

1.1样品提取及稀释：

一般固体样品：

甲醇水提取法：准确称取试样5.0g于50mL离心管中，加准确加入20.0mL甲醇-水（7+3），以均质器高速搅拌提取3min或摇床震荡20min。槽纹滤纸或普通滤纸过滤，准确移取8.0mL滤液并加入42.0mL1%Tween-20 PBS或1%TritionX-100PBS稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，量取25mL滤液备用。（该方法与国标方法部分改动，增加了玻璃纤维滤纸过滤；不过滤会出现堵柱子的现象）

乙腈水提取法：准确称取试样5.0g于50mL离心管中，加准确加入20.0mL乙腈-水（84+16），以均质器高速搅拌提取3min或摇床震荡20min。槽纹滤纸过滤或6000RPM离心10min，准确移取4.0mL滤液并加入46.0mL1%Tween-20 PBS或1%TritionX-100PBS稀释，备用。

1.2样品的净化

  一般固体样品：

    将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确处理好的样品滤液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入2.0mL色谱级甲醇洗脱，将2.0mL淋洗液在50℃氮气下吹干，用1mL流动相定容后，混匀，注入HPLC检测。

2老国标方法：

2.1样品提取及稀释：

大米、玉米、小麦、坚果、调料、花生及其制品：

准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及准确加入125.0mL甲醇-水（7+3），以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取15.0mL滤液并加入30.0mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

植物油脂：

准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及入125.0mL甲醇-水（7+3），以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取15.0mL滤液并加入30.0mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

酱油：

称取试样50.0g于250.0mL具塞锥形瓶中，加入2.5g氯化钠及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL，以均质器高速搅拌提取1min。槽纹滤纸过滤，准确移取10.0mL滤液并加入40.0mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

食醋：

准确称取5.0g样品，加入1.0g氯化钠，以pH7.0磷酸盐缓冲溶液稀释至25.0mL，混匀，定量滤纸过滤。取10.0mL滤液加入10.0mL pH7.0磷酸盐缓冲溶液，混匀。以玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

饲料：

准确称取试样50.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及入100.0mL甲醇-水（8+2），以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取10.0mL滤液并加入40.0mL pH7.0 PBS稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

2.2 样品的净化

大米、玉米、小麦、坚果、调料、花生及其制品、植物油脂：

 将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确移取15.0mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入2.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

酱油和食醋： 

 将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL 0.1%的吐温/PBS清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2 mL~3mL空气通过柱体。准确加入2.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

饲料：

将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水清洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2 mL~3mL空气通过柱体。准确加入2.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

注意事项

• 样品添加回收试验时，标准品添加到样品中，静置2小时后或过夜，再进行样品前处理，否则会出现回收率偏低的现象。
• 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。
• 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。
• 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过25%，否则会影响柱子的吸附能力。
• 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。

   需要准备的设备及试剂

物品

光化学衍生器

泵流操作架（配有1台空气泵，6个10mL针筒）

高速匀质器，转速可达18,000 r/min ~22,000 r/min

微纤维滤纸（1.5um，100张/盒）

折叠式槽纹滤纸（100张/盒），或中速定性滤纸

一次性塑料烧杯(25/包)

一次性测试管(250支/包)

塑料漏斗(10 个/包)

黄曲霉毒素混合标准品1.0mL （B1和G1为1.0ug/mL,B2和G2为0.3ug/mL）

色谱纯级的甲醇乙腈（4升/瓶）

C18 反相色谱柱4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

玉米、饲料等基质含有不同水平黄曲霉毒素的质控样品