黄曲霉毒素M1免疫亲和柱

使用对象

免疫亲和柱能够特异性的纯化牛奶及奶制品中黄曲霉毒素 M1。由于采用了先进的生物技术，该方法可以不使用有毒溶剂如氯仿和二氯甲烷检测黄曲霉毒素M1的含量。Afla M1黄曲霉毒素免疫亲和柱可以广泛地应用于牛奶加工厂质量管理实验室和政府检测实验室。此方法速度快、操作简单、准确性高，同时能做到提高奶质，不产生污染。

黄曲霉毒素M1免疫亲和柱适用于以下标准：

GB/T 18980-2003 乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定-免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法

GB/T 5413.37-2010 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定

GB 5009.24-2016 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定

原理

样品经前处理后，然后通过键合有黄曲霉毒素特殊抗体的免疫亲和柱。此时，黄曲霉毒素M1被亲和柱中的抗体特异性的吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将黄曲霉毒素M1从亲和柱上洗脱下来。最后，用HPLC或荧光计进行定量检测

储存条件

该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。

 

实验溶液制备

• HPLC流动相，水-乙腈-甲醇（68+24+8，v/v）：取240mL乙腈和80mL水甲醇加680mL水，混合均匀，用0.22微米的尼龙筛过滤。
• 标准溶液的配制：取黄曲霉毒素M1标准品，用流动相稀释到所需工作浓度。
•  注：配制好的标准品溶液2-8℃冷藏保存有效期为24h。

液相色谱条件

色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流动相：水-乙腈-甲醇（68+24+8，v/v）

流速：0.8mL/min

检测器：荧光检测器: 激发波长360nm,发射波长440nm

  紫外检测器：波长365nm（紫外检测方法：建议标准曲线浓   度:5-50ng/ml）

进样体积：20~100uL

 

分析步骤

1 新国标GB 5009.24-2016方法：

1.1 样品提取及稀释：

  液态乳、酸奶：

称取 4g 混合均匀的试样(精确到 0.001g )于 50mL 离心管中, 加入 10mL 甲醇,涡旋 3min 。置于 4 ℃、6000r / min 离心10min 或经玻璃纤维滤纸过滤,将适量上清液或滤液转移至烧杯中,加 40mL 水或 PBS 稀释,备用。

乳粉、特殊膳食用食品：

称取1g样品(精确到0.001g)于50mL离心管中,加入4mL 50℃热水,涡旋混匀。如果乳粉不能完全溶解,将离心管置于 50℃的水浴中,将乳粉完全溶解后取出。待样液冷却至20℃后,加入10mL甲醇,涡旋3min。置于 4℃、6000r/min下离心10min或经玻璃纤维滤纸过滤,将适量上清液或滤液转移至烧杯中,加40mL 水或PBS稀释,备用。

奶油：

称取1g样品(精确到0.001g)于50mL离心管中,加入8mL 石油醚,待奶油溶解,再加9mL 水和11mL 甲醇,振荡30min,将全部液体移至分液漏斗中。加入0.3g氯化钠充分摇动溶解,静置分层后,将下层移到圆底 烧瓶中,旋转蒸发至10mL以下,用PBS稀释至30mL。

奶酪：

称取1g已切细、过孔径1mm~2mm 圆孔筛混匀样品(精确到0.001g)于50mL离心管中,加入1mL水和18mL甲醇,振荡30min,置于4℃、6000r/min下离心10min或经玻璃纤维滤纸过滤,将适量上清液或滤液转移至圆 底烧瓶中,旋转蒸发至2mL以下,用PBS稀释至30mL。

1.2样品的净化

免疫亲和柱内的液体放弃后,将上述样液移至50mL注射器筒中,调节下滴流速为1mL/min~3mL/min。待样液滴完后,往注射器筒内加入10mL水,以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后,用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统,在亲和柱下放置10mL刻度试管,取下50mL的注射器筒,加入 2×2mL乙腈(或甲醇)洗脱亲和柱,控制1mL/min~3mL/min下滴速度,用真空泵抽干亲和柱,收集 全部洗脱液至刻度试管中。在50℃下氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,用初始流动相定容至1.0mL,涡 旋30s溶解残留物,0.22μm 滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样。

2 老国标方法：

2.1样品提取及稀释：

乳：

量取100mL混匀的试样，置于两个50 mL具塞离心管中，在水浴中加热到35℃～37 ℃。在4000~6000 g下离心15 min。收集并混合上清液，用移液管移取50mL上清液供净化处理用。

发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)：

称取100 g(精确至0.01 g)混匀的试样，用0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4，高速匀浆5 min。在4000~6000 g下离心15 min。收集并混合上清液，用移液管移取50mL上清液供净化处理用。

乳粉和粉状婴幼儿配方食品：

称取 10 g(精确至0.01 g)试样，置于250 mL 烧杯中。将50 mL 已预热到50 ℃的水加入到乳粉中，用玻璃棒将其混合均匀。如果乳粉仍未完全溶解，将烧杯置于50℃的水浴中放置30 min。溶解后冷却至20 ℃，移入100 mL 容量瓶中，用少量的水分次洗涤烧杯，洗涤液一并移入容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀后分别移至两个50 mL离心管中，在4000~6000 g离心15 min，混合上清液，用移液管移取50mL上清液供净化处理用。

干酪：

称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，加20 mL水和30 mL甲醇，高速匀浆5 min，超声提取30 min，在4000~6000 g下离心15 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL石油醚振摇2 min，待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL，浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中，加水稀释至约50 mL，在4000~6000 g下离心 5 min，上清液供净化处理。

奶油：

称取5g(精确至0.01 g)试样，置于50 mL烧杯中，用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中，待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。

2.2样品的净化

 将以上试液提取液移至50 mL 注射器筒中，调节固相萃取装置的真空系统,控制试样以1~2滴/秒稳定的流速过柱。取下50 mL 的注射器筒，装上10 mL 注射器筒。注射器筒内加入水，以稳定的流速洗柱，然后，抽干亲和柱。脱开真空系统，在亲和柱下部放入10 mL 刻度试管，上部装上另一个10 mL 注射器筒，加入4 mL 乙腈,洗脱黄曲霉毒素M1，洗脱液收集在刻度试管中，洗脱时间不少于60 秒。然后用氮气缓缓地在30 ℃下将洗脱液蒸发至近干 (如果蒸发至干，会损失黄曲霉毒素M1 )，用流动相稀释至1 mL。

注意事项

• 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。
• 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。
• 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过20%，否则会影响柱子的吸附能力。
• 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。
• 当用氮气浓缩洗脱液时，氮气流不要太大，否则会损失部分黄曲霉毒素M1

 

   需要准备的设备及试剂

物品

泵流操作架

高速匀质器，转速可达18,000 r/min ~22,000 r/min

微纤维滤纸（1.5um，100张/盒）

折叠式槽纹滤纸（100张/盒），或中速定性滤纸

一次性塑料烧杯(25/包)

一次性测试管(250支/包)

塑料漏斗(10 个/包)

黄曲霉毒素M1标准品

色谱纯级的甲醇和乙腈（4升/瓶）

C18 反相色谱柱4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

奶粉等基质含有不同水平黄曲霉毒素的质控样品